【論文紹介】Tregの抑制能にTCRが必要(3・最終回)
今回紹介するのは以下の論文です。
Vahl JC, Drees C, Heger K, et al. Continuous T cell receptor signals maintain a functional regulatory T cell pool. Immunity. 2014;41(5):722-736. doi:10.1016/j.immuni.2014.10.012
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1074761314003884
前回の記事はこちら：【論文紹介】Tregの抑制能にTCRが必要(2)
Fig 4
末梢Tregの恒常性維持にTCRシグナルが必要
poly I:Cを投与するとTCRβ鎖が除去されます。
TCRが無いとアゴニスト選択も行われないため、Tregはそもそも生まれません。
T細胞が分化する臓器である胸腺で、Foxp3+のT細胞がほとんどいないのはそのためです(Fig 4A)
胸腺から新たにTregが来ないということは、poly I:C投与までに生まれたTregが末梢でどのように維持されているのかを観察することができるということです。
ナイーブなTCR欠損Tregは、時間が経過するにつれて減少していきます。
それに対し、TCRがあるTregは減少していませんでした。
TregだけじゃなくCD4+ナイーブT細胞全体が、TCRを欠損すると減少する、という報告もあります。
TCR欠損Tregは増殖できない
TCR欠損したTregが生き残れなかったのか、増殖できなかったのか、それとも両方なのかを検証するため、
まずは増殖マーカーであるKi67で染色を行ったところ、
TCR欠損TregはKi67を発現していませんでした。
つまり、TCRが欠損することによってTregが増殖できていないことが示されました。
より直接的にこれを示すため、筆者らはマウスの飲料水にBrdU(ブロモデオキシウリジン)を入れました。
BrdUは核酸に似た構造を持つ偽物で、細胞増殖が盛んであればあるほど、BrdUが取り込まれていきます。
BrdU特異的な抗体を用いることで、細胞増殖を見ることができます。
BrdU抗体で染まったTCR欠損Tregの割合は、CD25 high TCR＋Tregに比べて大幅に減少していました。
TCR欠損Tregは、サイトカインで生き残ろうとしている
TCR+/- Tregをin vitroで1時間培養したところ、
TCR欠損Tregにおける活性化したカスパーゼの発現量が高くなりました。
in virtoでは、TCRシグナルが無いとTregはアポトーシスを起こして死んでしまいます。
一方、in vivoでは、TCR欠損Tregはあまり死んでいないことが、死細胞染色によってわかっています。
この齟齬をどのように説明するか。
IL-2やIL-7などのサイトカインがTregのホメオスタシスに必要であることが知られています。
そして、TCR欠損TregはIL-2の受容体であるCD25の発現や、
IL-2,IL-15の受容体であるCD122,IL-7の受容体であるCD127の発現が上昇していました。
つまり、in vivoでは、TCR欠損Tregは、TCRシグナルが来ないことによる細胞死を防ぐために、
サイトカインによって生き残ろうとしていたと考えられます。
サイトカインをよりたくさん受け取るために、受容体の発現量も増加していたのだと考えられます。
in vitroに持ってくるとサイトカインが無いために細胞が死んでしまうと考えられます。
このことの傍証として、IL-2やIL-6で刺激を受けた時のシグナル伝達の入り方は、
TCRを欠損していても同じくらい強いということが、
シグナルの下流にあるSTAT5やSTAT3のリン酸化状態の測定によってわかりました。
Fig 5
TCRの下流にあるmTOR経路がTCR欠損によって弱まる
mTORファミリーである、mTOR1とmTOR2を介したシグナル伝達経路は非常に複雑です。
TCR欠損TregにおけるmTOR自体のリン酸化は減少していました。
- mTOR1の下流にあるシグナルには、
コレステロールの合成経路などTCR欠損により変化したものもあれば、
活性酸素の合成経路など、変化しなかったものもありました。
- mTOR2の下流にはアポトーシス関連分子があります。
アポトーシスを促進するBim↑
mTOR2が行うAktのリン酸化状態↓
Aktが行うFoxO1のリン酸化状態↓
アポトーシスを抑制するBcl-xL↓
アポトーシスを抑制するBcl-2↑(Bimと拮抗して増えている？)
TCRを欠損するとアポトーシスも起こりやすくなるようです。
Fig 6
TCR欠損TregはIL-10産生能力が低く、抑制性の遺伝子発現も弱い
Tregの「抑制能」は様々なメカニズムが関与しています。
- IL-2をTconvの代わりに消費する
- 抑制性のサイトカイン、IL-10,IL-35,TGF-βを放出する
- 細胞を殺す分子、パーフォリン, グランザイムを出す
- 抗原提示細胞がT細胞を(共)刺激する能力を調整する
発現量に有意に差のあった10個の抑制性の分子のうち、
8つはTCR欠損によって発現が低下し、2つはTCR欠損によって発現が上昇していました。
また、PMAとイオノマイシンを使ってそれぞれのTregをin vitro刺激したところ、TCR欠損Tregの方がIL-10の産生量が少ない、という結果になりました。
しかし、IL-2やIFN-γの量は変化しませんでした。
元々TCRβ+TregでもIL-2やIFN-γの産生量は少なく、むしろこれはアナジーな状態が維持されていることを意味しています。
場所ごとに分けて解析すると、結腸におけるIL-10産生能は、TCRを欠損していても変化していないということが分かりました。
結腸では例外的に、IL-10産生にbasalシグナルを必要としないということが分かりました。
これらの結果から、筆者は
basalなTCRシグナルがTregにおける抑制性遺伝子の発現やIL-10の産生に重要である、と結論付けました。
Fig 7
in vivoで、TCR欠損Tregの抑制能低下を示した
マウスの生体内で、Tregの抑制能を調べるために、筆者らは新しい系統のマウスを導入します。
CD4-cre-ERT2です。タモキシフェン投与依存的にTCRをノックアウトすることができます。
こちらの方がよりノックアウト効率が良く、3mg、または5mgのタモキシフェンを5日連続で投与すると、70%のTregがTCRを欠損します。
筆者らは、CD4-cre-ERT2 Trca Fl/FlマウスからTregを取り出し、
WT(遺伝子改変の無い)ナイーブなTconvと共にT細胞欠損マウスに移入しました。
つまり、移入した細胞のみで免疫系を構築してしまう実験系です。
移入した後でタモキシフェンを投与し、TregからTCRを取り除きます。
投与後3日目にマウスを解析すると、脾臓では67%,腸間膜リンパ節では55%のTregがTCRを欠損していましたが、投与後20日目にはTreg全体の20%がTCRを欠損していました。
つまり、TCR＋Tregの方が選択的に増殖したということです。
タモキシフェンを投与すると体重が減少します。
TCR欠損Tregは、普通のTregを投与した時に比べて、
体重減少からの回復が遅いという傾向が見られました。
TCR欠損Tregを入れたマウスでは、colitis(大腸炎)を発症したマウスや、下痢を起こしたマウスもいました。
さらに、炎症が起きている証しとして、脾臓や腸間膜リンパ節の重さが上昇していました。
好酸球、単球、マクロファージ、好中球の量も増加していたので、臓器の重さが増加したのはこれが原因だと思われます。
Tconvの方も解析すると、
CD4+T細胞の数が増え、それらは活性化した表現型(CD69発現)を持っていました。
特にTh17が増加していました。
Th17は自己免疫疾患や炎症性疾患に関与し、Tregによって抑制されていることで有名です。
TCR欠損TregはEAEを全く抑えられない
TCR欠損Tregが実際の自己免疫疾患を抑える能力を比較するために、
筆者らは実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)モデルを使用しました。
ジフテリア毒素を投与することによって、Tregを除去したのちに、
TCR欠損orTCR+ Tregを移入します。
その後、MOGペプチド をアジュバンドと共に入れた後に、疾患が発症する様子を観察します。
すると、Tregを入れなかった時と同じくらいひどいEAEを、
TCR欠損Tregを移入したマウスは発症しました。
この論文の紹介は以上になります。
個人的な感想
この論文ではやっていませんが、次世代シーケンサー(NGS)の普及によって網羅的な解析が可能になった結果、
矛盾する結果が生まれやすくなっていると感じます。
私が情報解析に疎いせいもありますが、論文を正確に理解するのが難しくなると共に、データの扱いを恣意的に行える危険性がますます増加しているように思います。
