【論文紹介】ナイーブなCD4T細胞が受け取るTCRシグナルに強弱がある(2)
今回は以下の論文のResultを紹介します。
Zinzow-Kramer, Wendy M., Arthur Weiss, and Byron B. Au-Yeung. “Adaptation by naïve CD4+ T cells to self-antigen–dependent TCR signaling induces functional heterogeneity and tolerance.” Proceedings of the National Academy of Sciences 116.30 (2019): 15160-15169.
https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.1904096116
前回の記事はこちら：【論文紹介】ナイーブなCD4T細胞が受け取るTCRシグナルに強弱がある(1)
Result
Polyclonalな系を用いて、細胞をNur77-GFP強度で3段階に分ける
TCRを1種類に固定すると、そのTCRの自己ペプチドとの親和性に応じて、basalシグナルの強度も変化します。
- 弱いbasalシグナルを入れるTCRの例として、OTIIがあります。
これは卵白アルブミンに含まれるOVAペプチドを特異的に認識するTCRで、
マウスの体内には抗原が存在しないため、OTIIと自己pMHCとの親和性は低くなっています。
- 強いbasalシグナルを入れるTCRの例として、ANDがあります。
ミトコンドリアに存在するシトクロムcというタンパク質に含まれるペプチドを認識します。
いわゆる自己反応性のTCRであり、自己ペプチドとの親和性も高いです。
TCRを固定しないマウス、ANDマウス、OTIIマウスでNur77-GFPの蛍光強度を比較すると当然、
OTII < TCR non-fixed < AND
になります。
ちなみに、TCR複合体に含まれるCD3のζ鎖、142番目のチロシンのリン酸化状態にもこのような不等号が成り立ちます。(1)でも扱ったITAMドメインだと思われます。
TCRを固定していても、GFPの蛍光強度にはばらつきがあります。
Fig S1には染色無しのネガコンが重ねられていないため、確かなことは言えなくなってしまうのですが、
蛍光強度には10^2オーダーくらいの幅がある、と主張されています。
親和性、というパラメーターが固定されている状態なので、ここでGFPの差を生み出しているのは抗原の濃度かと思われます。
もしくは、親和性の異なる抗原が何種類か存在することも考えられます。
今後は、ナイーブなCD4+T細胞をNur77-GFPの蛍光強度を元に3段階に分けて解析を進めていきます。
GFPlowの集団にはTCRが無いことによってシグナルが入っていないだけの可能性があります。
これを排除するために、TCRβ鎖の発現量がGFP high, intermediate, lowで同程度であることを示しています。
また、GFPの強さの差が、TCRの量によるものではないと明示しています。
仮説：「GFP発現が高いとTCR刺激への反応も素早くなる？」
この仮説を検証するために、筆者らはCD25-(Tconv)CD44low(naive)CD4+細胞を、
Nur77GFP強度の上位15%: HI , 下位15%: LO, 中間 : MEDに分けてソートしました。
そして、TCR配列関係なく一様にTCR刺激を入れ、一晩反応させた後に解析を行いました。
まずはNur77-GFPの発現を見たところ、3集団共にNur77の発現が上昇していました。
刺激後のNur77発現量に、有意な差は見られないレベルでした。
一方、TCR刺激を入れないと、Nur77-GFPの差は維持されたままでした。
16時間後 : Nur77-GFP、CD5の発現が高いとIL-2の分泌量は少なくなる
TCR刺激を入れると、CD25,CD69の発現も上昇していましたが、
GFP HIの方がCD25の上昇が弱い傾向にありました。
そして,IL-2分泌細胞の割合は、GFP発現が高いほど低い傾向にありました。
CD5に関しても同様の結果が得られました。
4時間後 : CD5とNur77-GFPで正反対の傾向が見られる
この結果を以て、「basalシグナルが強いとTCR刺激が入った後のIL-2の量が少なくなる」と結論づけるのは早計です。
筆者らは、basalシグナルが強く入った細胞はもっと早い段階でIL-2を出しているのではないかと思い、刺激を入れて4時間後にIL-2の分泌量を測定しました。
3種類のTCR刺激を入れ、同じ結果であることを確かめています。
- PMA-イオノマイシン刺激後にIL-2を核内染色する
PMAとはPhorbol myristate acetateのこと。
強く非特異的なTCR刺激を与えることによって、サイトカインを産生させます。
機序は、以下のサイトに書いてありました。
http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?mode=view;Code=1603 "PMAはdiacylglycerolの代わりとしてprotein kinase Cを活性化しIonomycinは細胞内カルシウム濃度を上昇させます。"
TCRシグナルの中間地点に働きかけることによってTCR刺激を模倣しています。
- CD3ε抗体
CD3のζ鎖は細胞質側にありますが、ε鎖は細胞表面に2つずつあります。
- 抗原提示細胞の表面にペプチド断片をまぶして入れる
上記2つは、TCR刺激16時間後の解析でも行なった方法です。
結果、CD5 HIとCD5 LOをソートし比較した場合は、basalシグナルの強いCD5 HIの方がIL-2産生細胞の割合が高くなりました。
反応の初期にCD5 HIが働き、後期にCD5 LOが生き残って機能する、
というこれまで考えられてきたモデルに一致する結果です。
一方、Nur77-GFP HIとLOをソートし比較した場合、basalシグナルの強いGFP HIの方がIL-2産生細胞の割合が高くなりました。
つまり、Nur77-GFP HIとCD5 HIが異なる細胞を内包している、
という新たな可能性が示唆されました。
CD5, Nur77-GFP, Ly6Cの発現は「大体」相関している
筆者らが次に立てたquestionは、「CD5とNur77-GFPとLy6Cの発現は対応しているか？」というものでした。
CD5-GFP、GFP-Ly6C、Ly6C-CD5という3種類の組み合わせで2次元展開を行い、正または負の相関が見られるか調べました。
すると、完全に綺麗な相関が見られるというわけではなく、
- CD5 HI やCD5LOには割と広い範囲のNur77-GFP発現が見られる
- TCRの種類に依存して、GFP MEDはLy6C＋だったりLy6C-だったりする
といった例外が認められました。
確かに言えることは、
- Nur77-GFP HI,CD5 HI,Ly6C LOはbasal刺激が強い
- Nur77-GFP LO,CD5-LO,Ly6C HIはbasal刺激が弱い
ということで、筆者らは今後、
Nur77-GFPとLy6Cでbasal刺激の強弱を定義すると述べています。
弱い順にA~Dをナンバリングし、
Nur77-GFP LO, Ly6C HIがA, Nur77-GFP MED, Ly6C HIがB, Nur77-GFP MED, Ly6C LOがC, Nur77-GFP HI,Ly6C LOがD,
として比較しています。
Tregの多くはNur77-GFP HI,Ly6C-である
Tregは自己ペプチドへの親和性が高いことで知られています。
ではTregのCD5, Nur77-GFP, Ly6C発現はどれくらい高い/低いのでしょうか？
先ほど「強いbasalシグナルが入っている」集団と定義した、Nur77-GFP HI,Ly6C-の集団の割合が高いことがわかりましたが、Ly6C+などのそうでない集団も存在していました。
実験系が簡単で助かります。(3)に続きます。
